Les anciens microbiomes oraux soutiennent les changements alimentaires néolithiques progressifs vers l'agriculture

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6927 (2022) Citer cet article

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Le microbiome humain est récemment devenu une source précieuse d'informations sur la vie et la santé des hôtes. À ce jour, on sait peu de choses sur son évolution au cours des phases clés de notre histoire, comme la transition néolithique vers l'agriculture. Ici, nous mettons en lumière l'évolution vécue par le microbiome oral au cours de cette transition, en comparant les chasseurs-cueilleurs du Paléolithique aux agriculteurs du Néolithique et de l'âge du cuivre qui peuplaient une même zone restreinte en Italie. Nous intégrons l'analyse de 76 microbiomes oraux de tartre dentaire avec les informations alimentaires dérivées de l'identification des restes de plantes incrustées. Nous détectons une déviation plus forte de la composition du microbiome des chasseurs-cueilleurs dans la dernière partie du Néolithique, alors que dans une moindre mesure dans les premières phases de la transition. Nos résultats démontrent que l'introduction de l'agriculture a affecté le microbiome de l'hôte, soutenant l'hypothèse d'une transition progressive au sein des populations étudiées.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont identifié le microbiome comme un type d'interface entre l'homme et son environnement. Le microbiome humain est capable d'influencer la santé de l'hôte par plusieurs mécanismes1,2, et il est à son tour façonné par des variables liées aux conditions de vie de l'hôte (par exemple, mode de vie, environnement), plus que par la génétique de l'hôte3,4. Depuis le début des analyses métagénomiques du microbiome humain, l'existence d'énormes degrés de variabilité dans la composition du microbiome intestinal parmi différentes populations à travers le monde a été mise en évidence5,6. Néanmoins, comment ces communautés microbiennes sont apparues au cours de l'évolution humaine et ont co-évolué avec leurs hôtes restent des questions ouvertes.

Les études sur l'ADN ancien (ADNa) peuvent potentiellement nous permettre d'expliquer comment ces communautés microbiennes complexes ont évolué au fil du temps pour atteindre leur composition actuelle, et de plus, elles peuvent fournir des informations substantielles sur les sociétés, les cultures et les conditions de vie passées7,8. Les chercheurs envisagent maintenant l'étude du microbiome ancien des coprolithes (c'est-à-dire des restes fécaux fossilisés) et du tartre dentaire comme des outils qui pourraient contribuer considérablement à révéler l'évolution des communautés microbiennes associées à l'homme9,10.

L'une des questions en suspens concernant l'évolution du microbiome humain est liée à la façon dont la transition vers l'agriculture au cours de la période néolithique a façonné la composition et la biodiversité du microbiome oral. Les analyses menées sur les populations modernes ont détecté des changements dans l'écologie microbienne orale lors de la comparaison des sociétés traditionnelles ou de chasseurs-cueilleurs avec les communautés urbaines11,12,13,14. Cependant, des études récentes qui se sont concentrées sur la transition vers l'agriculture au cours de notre passé ont montré des résultats controversés. Par exemple, des données préliminaires sur le microbiome oral ancien ont suggéré un changement dans l'abondance des espèces bactériennes lié à la transition néolithique, qui n'était pas reproductible dans une étude plus récente sur l'évolution du microbiome oral8,15. Des recherches supplémentaires en Europe du Sud ont trouvé peu de variation associée à la transition, identifiant principalement des schémas géographiques de variation du génome bactérien16. À ce jour, les études sur le microbiome néolithique ancien se sont principalement appuyées sur de petits groupes d'échantillons répartis sur une vaste zone géographique caractérisée par des conditions écologiques et des stratégies de subsistance distinctes, introduisant ainsi de possibles biais géographiques et alimentaires. En effet, comme observé pour différentes sources de microbiome, les communautés microbiennes qui habitent la plaque dentaire semblent être influencées par l'alimentation, l'écologie et les conditions de vie17,18,19. De plus, des preuves archéologiques suggèrent que la transition néolithique n'était pas un événement monolithique, mais des différences se sont produites dans les stratégies de subsistance adoptées par les communautés contemporaines20,21,22. Cette preuve peut expliquer pourquoi, les modèles géographiques de variation sont principalement détectés plutôt que les changements culturels16, lors de la comparaison de différentes communautés néolithiques caractérisées par des échantillons de petite taille et des conditions écologiques différentes, laissant ainsi cette question ouverte. Ainsi, prêter attention à la fois au contexte archéologique et au contexte écologique devient fondamental pour contextualiser l'influence de la transition agricole sur le microbiome oral.

En Italie, la transition vers l'agriculture s'est amorcée vers 6 200 av. J.-C. au sud-est de la péninsule, dans une région actuellement connue sous le nom d'Apulie, où des populations venues du Levant ont atteint ces terres en suivant des routes migratoires à travers la mer Méditerranée23. Ici, le passage du chasseur-cueilleur à la subsistance agraire a été documenté comme le premier en Italie et comme l'un des plus anciens en Europe occidentale23. Les premières phases ont été caractérisées par quelques groupes de familles, organisés en petits villages avec un type typique de production de céramique appelée "Impressed Ware"23. Au cours des deux millénaires suivants, ces communautés se sont étendues vers le nord, développant des structures sociales plus complexes, et adaptant également leur système agraire de subsistance en réponse aux ressources locales et aux conditions environnementales24. Au cours de la dernière décennie, cette région a fait l'objet de multiples investigations paléodiététiques et paléoécologiques visant à reconstituer la dynamique de la néolithisation, représentant ainsi un cas d'école parfait pour étudier la relation entre l'hôte et le microbiome au moment de la transition24,25,26. Dans l'ensemble, la période néolithique dans cette zone est divisée en quatre phases culturelles principales : précoce (corresp. culture de la céramique imprimée), moyenne (corresp. culture Passo di Corvo), moyenne finale (corresp. culture Serra d'Alto) et néolithique tardif (corresp. culture Diana)23.

Ainsi, l'objectif de la présente étude est d'aborder les questions liées aux effets du changement alimentaire néolithique sur le microbiome oral, en intégrant des informations alimentaires, culturelles et environnementales. Nous proposons une approche alternative pour étudier l'évolution de la composition du microbiome en relation avec la transition agricole, en minimisant les éventuels biais géographiques et en nous concentrant exclusivement sur le centre-sud de l'Italie comme étude de cas (en particulier sur la région des Pouilles) et en tenant compte du contexte culturel et alimentaire de chaque communauté. Nous analysons d'abord neuf échantillons de chasseurs-cueilleurs du Paléolithique supérieur de la grotte de Paglicci (31 000–11 000 avant JC), à la fois pour décrire plus en détail le microbiome pré-agricole et pour obtenir une référence régionale à comparer avec les spécificités néolithiques. À ce jour, aucun individu mésolithique n'a été détecté dans cette zone. Pour mieux aborder les changements liés à la transition, nous nous concentrons sur un ensemble de 67 échantillons allant du néolithique (6200-4000 av. J.-C.) à l'âge du cuivre (3500-2200 av. J.-C.), traversant les quatre phases qui ont constitué la période néolithique dans cette zone, et correspondant à des contextes culturels distincts. De plus, pour élargir le contenu informatif du tartre dentaire ancien, nous avons appliqué une approche intégrée couplant les données métagénomiques à l'analyse microscopique pour obtenir des informations diététiques concernant les plantes consommées. Nous identifions deux changements précédemment non décrits dans la composition du microbiome des populations étudiées. La première modification s'est produite entre les communautés locales de chasseurs-cueilleurs et les agriculteurs néolithiques, tandis qu'un deuxième changement majeur inattendu a été identifié dans la dernière partie de la période néolithique. Certains des changements taxonomiques et fonctionnels ont probablement été entraînés par des changements dans les stratégies de subsistance.

Nous avons collecté 79 échantillons du centre-sud de l'Italie (Fig. 1), en considérant des échantillons de chasseurs-cueilleurs du Paléolithique supérieur (PA), de l'âge du cuivre post-néolithique (CA), et en traversant toutes les différentes phases du néolithique (données supplémentaires 1): Néolithique ancien (EN), Néolithique moyen (MN), la partie finale du Néolithique moyen (FMN) et Néolithique tardif (LN). Soixante-seize (76) des échantillons collectés ont été étudiés pour leurs profils métagénomiques. Une moyenne de 28 millions de lectures par échantillon a été produite (Données supplémentaires 2). Parmi ceux-ci, une moyenne de 12,94 % de lectures pourrait être attribuée aux bactéries et aux archées, avec seulement une petite partie aux eucaryotes (une moyenne de 0,01 %). Les anciens profils de microbiomes obtenus ont été regroupés avec d'autres anciens microbiomes oraux publiés et des échantillons oraux modernes (Données supplémentaires 3 et Fig. 1 supplémentaires). Pour confirmer la robustesse de nos résultats, nous les avons corroborés par l'analyse Sourcetracker, où la majorité des échantillons anciens (71) ont montré une forte adhérence au profil du microbiome oral (> 90%) (Fig. 2 supplémentaire). Seuls quelques échantillons présentaient un profil contaminé et ont donc été exclus des analyses ultérieures.

Répartition des sites archéologiques échantillonnés dans la péninsule italienne centre-sud. Le nombre d'échantillons par site est présenté entre parenthèses. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source. La carte a été générée à l'aide du package rnaturaleartch (v 0.1.0) sur le logiciel R.

Nous avons sélectionné les espèces microbiennes les plus abondantes qui ont montré une abondance relative supérieure à 0,02 % dans l'ensemble des données. Ce seuil nous a permis d'obtenir un total de 49 espèces, en évitant les espèces peu abondantes et les singletons. Les espèces obtenues ont par conséquent été validées pour leurs profils de désamination (Données supplémentaires 4 et Fig. 3 supplémentaires). Un profil de désamination proche parmi tous les échantillons a été détecté, sans qu'aucune différence significative ne se produise au fil du temps (voir la discussion supplémentaire et les figures supplémentaires 4 et 5 pour plus d'informations taphonomiques).

Nous avons effectué une analyse de réseau pour explorer les similitudes d'échantillons, en détectant cinq groupes différents (C1-5) (Fig. 2a). La subdivision des grappes a été validée à l'aide de PERMANOVA et du test ANOSIM sur une représentation PCoA, confirmant qu'elle était véritablement influencée par la composition du microbiome et non liée à d'autres facteurs de confusion (c'est-à-dire, extraction ou lot de bibliothèques, ou nombre de lectures) (Figs supplémentaires. 6, 7 et données supplémentaires 5a et b). Selon la classification aléatoire des forêts, la période a été identifiée comme le facteur principal à l'origine de ces distinctions de grappes, l'emplacement géographique étant un facteur secondaire (Fig. 2b). Ainsi, on peut supposer un effet de mélange du temps et de la géographie, la période chorologique ayant une influence un peu plus lourde que la géographie. En fait, l'analyse d'association entre les grappes et la période (Fig. 2c et Fig. 8 supplémentaire) a indiqué que la première grappe (C1) était significativement associée à la période PA, tandis que la seconde (C2) était principalement associée aux échantillons du Néolithique ancien (EN) et moyen (MN). Le site de Palagiano, qui appartient à la fin du Néolithique moyen (FMN), a été associé à la fois au C3 et au C5, suggérant ainsi la possibilité d'une autre sous-structure au sein du même site. Il est à noter que C3 est principalement constitué d'échantillons appartenant à la même tombe (PT10.x), tandis que C5 est formé d'échantillons appartenant à différentes sépultures trouvées à Palagiano. Enfin, C4 est plutôt associé de manière significative aux périodes du Néolithique final (LN) et de l'âge du cuivre (CA), quelle que soit la géographie.

a Analyse de réseau parmi les échantillons. L'épaisseur des bords est basée sur leurs poids, qui indiquent des similitudes non négatives entre les échantillons, tandis que la longueur des bords représente la distance des nœuds basée sur la distance d'Aitchison. La couleur du nœud est définie par le cluster identifié par l'analyse de cluster hiérarchique, et la coloration de la bordure noire autour du nœud identifie les hubs. b Résultats de l'analyse de la classification aléatoire des forêts, soulignant l'importance de la période et de la géographie (site) en tant que principales variables à la base des différences entre les grappes, tandis que l'âge du décès (Age) n'est pas déterminant. c Correspondance de la période d'investigation (c.-à-d. chronologie), avec le contexte culturel (deuxième bloc), le site archéologique sélectionné (troisième bloc) et les résultats de l'analyse typologique (C1-C5) rapportés dans le panneau a. Dans le bloc "Fond culturel", chaque culture néolithique est définie par une couleur différente, qui met en évidence son association aux sites archéologiques (troisième bloc) et à la phase néolithique spécifique signalée dans les rubriques du bloc "Amas" (c'est-à-dire EN, MD, FMN, LN). Dans le dernier bloc (c'est-à-dire appelé "Clusters"), les numéros d'échantillons sont rapportés sur l'axe des x et les annotations de cluster sur l'axe des y. La couleur de chaque barre est associée aux couleurs des clusters rapportées dans le panneau a. Dans chaque barre, le pourcentage d'échantillons appartenant à un groupe spécifique est indiqué en gras. Ici, en suivant les rangées de grappes, nous pouvons apprécier que les échantillons PA tombent ensemble dans la première grappe (C1), tandis que EN et MN dans la C2. LN et CA sont particulièrement présents en C4, tandis que FMN se répartit entre C3 et C5. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

Ces preuves suggèrent l'existence d'un profil de microbiome spécifique associé aux échantillons de chasseurs-cueilleurs d'AP, et de plus, que certaines différences sont détectables même au sein de la même période néolithique. En particulier, les échantillons qui appartiennent aux premiers siècles de la transition néolithique dans cette zone montrent une composition de microbiome très similaire entre eux, et une distinction évidente de celles des échantillons correspondant aux périodes LN et CA. Quarante-deux (42) espèces ont été identifiées à partir de l'analyse DESeq2 comme étant réparties différemment entre les groupes, certaines d'entre elles appartenant à des complexes écologiques bien connus pour le microbiome oral27 (Fig. 3a – e, Données supplémentaires 6). La plupart des espèces appartenant au même complexe présentent une tendance similaire, comme prévu pour être métaboliquement interdépendantes et écologiquement associées27. Parmi les espèces qui caractérisent ces complexes, on peut observer deux tendances taxonomiques principales : l'une pour les espèces peu représentées dans les échantillons d'AP, mais qui commencent à augmenter avec le début de la transition néolithique ; et une deuxième tendance, selon laquelle les espèces qui sont plus répandues dans les échantillons d'AP ont tendance à diminuer lentement au fil du temps, atteignant leurs niveaux les plus bas dans LN et CA. Des espèces importantes appartenant aux complexes rouge (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia et Treponema denticola), orange (Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae et Prevotella intermedia) et verte (Capnocytophaga endotelialis, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena et Eikenella corrodens) suivent la première tendance ; ainsi, ils sont faiblement présents dans les échantillons d'AP, puis ils deviennent progressivement plus représentés au début de la période néolithique, mais ce n'est qu'à la fin de cette période qu'ils atteignent la plus grande abondance. Pophyromonas gingivalis était également positivement associé à C4 à partir de l'analyse MaAsLin, et donc aux périodes LN/CA, tandis que Campylobacter gracilis était associé à la fois à C2 et C4 (Figure supplémentaire 9 et Données supplémentaires 7).

un complexe rouge ; b complexe orange ; c complexe violet ; d complexe jaune; e complexe vert. D'autres espèces orales importantes sont rapportées dans la Fig. 10 supplémentaire. Les échantillons (n ​​= 71) sont représentés par des points et sont colorés en fonction des espèces. Les boîtes à moustaches sont définies comme suit : les valeurs minimale, maximale et centrale représentent respectivement les quantiles 25, 75 et 50 % ; la médiane est représentée par le quantile de 50 % ; les moustaches supérieures et inférieures sont les valeurs maximales/minimales des données qui se situent dans la plage interquartile de 1,5 au-dessus du 75e ou au-dessous du 25e centile, respectivement. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

Les taxons des complexes violet (Actinomyces spp.) et jaune (Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis et Streptococcus sanguinis) ont suivi la deuxième tendance, étant très présents pendant la période AP et diminuant leur abondance au fil du temps. La seule exception en ce sens du complexe pourpre était Actinomyces sp. taxon oral 414 (Fig. 3c, graphique supérieur). De plus, dans ce cas également, le résultat MaAsLin a confirmé une forte association négative pour tous les Streptococcus spp. avec presque tous les groupes néolithiques et CA (Fig. 9 supplémentaire), tandis qu'une association positive d'Actinomyces naeslundii et d'Actinomyces slackii a été trouvée avec la période PA.

D'autres membres du microbiome oral ont considérablement modifié leur abondance au fil du temps, comme Olsenella sp. taxon oral 807, Parvimonas micra, Desulfomicrobium orale et Ottowia sp. le taxon oral 894, qui semble répandu parmi tous les échantillons néolithiques, tandis que Streptococcus sp. le taxon oral 061, Abiotrophia defectica et Klebsiella pneumonieae ont été enrichis dans l'ensemble de données PA (Fig. 10 supplémentaire). Olsenella sp. le taxon oral 807 a démontré un lien étroit avec la transition néolithique, puisque MaAsLin a mis en évidence une association positive avec C2 et C4, et donc avec les deux principaux groupes néolithiques, tandis que Desulfomicrobium orale était spécifiquement associé au groupe C4.

Les échantillons des premières phases du Néolithique (EN et MN), bien que provenant de sites archéologiques différents, ont montré un profil taxonomique assez homogène et une composition microbienne qui semble être en position intermédiaire entre les périodes PA et LN/CA. On peut ainsi faire l'hypothèse que la première phase du Néolithique constitue un type « d'état de transition » entre les deux extrêmes des compositions du microbiome PA et LN/CA. Ils se caractérisent par des éléments communs avec LN et CA, et en même temps, ils ne semblent pas si éloignés des compositions des échantillons de chasseurs-cueilleurs.

En plus de la composition taxonomique, nous avons également caractérisé les fonctions microbiennes afin de corroborer les analyses précédentes et de tester comment ces changements peuvent se refléter dans un ensemble fonctionnel génétique microbien. Nous avons détecté plusieurs orthologues KEGG comme étant spécifiques à chacun des groupes taxonomiques (Fig. 11 supplémentaire).

Les orthologues de KEGG liés au métabolisme des glucides (par exemple, le métabolisme du pyruvate, du propanoate, de l'ascorbate, des sucres aminés et de l'amidon) se révèlent particulièrement enrichis en échantillons de PA (Fig. 4a). On a récemment découvert que ces traits étaient principalement associés à la présence de Streptococcus, qui est plus élevée dans ce groupe d'échantillons, et à sa capacité à se lier aux protéines amylase de l'hôte8,28. Cependant, les échantillons néolithiques sont tous enrichis d'autres caractéristiques distinctives du métabolisme des glucides, telles que le métabolisme du galactose et le métabolisme du glyoxylate / dicarboxylate, ainsi que l'augmentation des voies des glycanes (Fig. 12A supplémentaire).

Les panneaux a et b rapportent des différences dans le métabolisme des glucides et des acides aminés de la période PA à CA. Le panneau c représente une augmentation de plusieurs facteurs de virulence au fil du temps selon la classification de Chen et al.91. Les échantillons (n ​​= 71), divisés par périodes, sont rapportés sur l'axe des x et l'abondance relative sur l'axe des y. Les boîtes à moustaches sont définies comme suit : les valeurs minimale, maximale et centrale représentent respectivement les quantiles 25, 75 et 50 % ; la médiane est représentée par le quantile de 50 % ; les moustaches supérieures et inférieures sont les valeurs maximales/minimales des données qui se situent dans la plage interquartile de 1,5 au-dessus du 75e ou au-dessous du 25e centile, respectivement. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

Plusieurs orthologues significatifs appartenant aux voies des acides aminés semblent augmenter avec le temps, tels que la biosynthèse de la lysine et la biosynthèse de la glycine et de la cystéine, qui atteignent une abondance plus élevée dans les échantillons LN et CA (Fig. 4b).

Même parmi le métabolisme des vitamines, nous avons trouvé des voies importantes qui ont changé au fil du temps, en particulier pour les vitamines B (Fig. 12B supplémentaire). Des différences dans les enzymes qui font partie de la voie de biosynthèse vers la cobalamine (vitamine B12) chez les bactéries sont présentes à la fois dans l'AP et dans les échantillons néolithiques. La cobalt-précorrine-6B (K02191) et la L-thréonine kinase (K16651) sont principalement représentées dans les échantillons de PA, avec une tendance à diminuer avec le temps, tandis que la percorrine-6Y C5,15 méthyltransférase (K00595) et l'adénosylcobinamide-GDP ribazoletransférase (K02233) augmentent à travers les phases néolithiques. Les échantillons néolithiques, en particulier LN et CA, sont enrichis dans le pool à un carbone par le métabolisme des folates, ainsi que par le métabolisme de l'acide lipoïque ; l'acide lipoïque est une autre vitamine du complexe B qui semble affecter la virulence et la pathogénicité bactériennes29.

Fait intéressant, nous avons détecté une augmentation générale du facteur de virulence parmi notre cohorte néolithique (Fig. 4c). Les orthologues KEEG impliqués dans la motilité bactérienne, l'évasion immunitaire, l'antiphagocytose et les endotoxines ont progressivement augmenté leurs abondances relatives au fil du temps, atteignant leurs niveaux les plus élevés dans LN et CA. Les espèces qui ont contribué à l'augmentation des niveaux de ces facteurs de virulence étaient P.gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, Capnocytophaga ochracea et Fusobacterium nucleatum.

Dans l'ensemble, comme observé dans l'analyse taxonomique, les sujets appartenant à la fois à EN et à MN avaient une composition fonctionnelle très proche (comme le souligne l'analyse exploratoire par grappes), qui était une sorte de position intermédiaire entre les deux états les plus différents observés dans les échantillons PA et LN-CA.

Les neuf échantillons de tartre dentaire appartenant aux échantillons du Paléolithique supérieur (PA) ont produit principalement des grains d'amidon, par rapport aux autres types de microrestes détectés, pour un total de 215 grains d'amidon simples (Discussion supplémentaire et données supplémentaires 8). Les grains d'amidon étaient principalement associés aux Poaceae, et particulièrement aux Triticeae et Avena sauvages cf. barbata (avoine, cf. folle avoine élancée). Enfin, des grains d'amidon particuliers ont été morphologiquement identifiés comme étant ceux du rhizome de Nuphar lutea (nénuphar jaune). Des grains d'amidon de nénuphar (pas de nénuphar jaune) ont également été trouvés dans le tartre dentaire de Néandertal30.

Pour les périodes Néolithique et Âge du Cuivre, 18 échantillons ont été analysés (Données supplémentaires 8). Au total, 25 grains d'amidon appartenant à deux morphotypes ont été extraits des échantillons. Les grains de morphotype I ont montré des caractéristiques diagnostiques pour le grain de type A de l'espèce de la tribu des Triticeae. Parmi les nombreux phytolithes, 16 épidermes dendritiques allongés ont été récupérés. Ces types de phytolithes dans le tartre dentaire sont normalement considérés comme une preuve directe de la consommation de céréales, car ils sont produits dans les bractées d'inflorescence des espèces de blé et d'orge31. Fait intéressant, de nombreuses diatomées du genre Nitzschia ont été récupérées, parmi lesquelles de nombreuses espèces d'eau douce et marines, généralement tolérantes à la pollution32. Enfin, il convient de mentionner la récupération de spores fongiques de sept individus des périodes néolithique et CA. Certaines des spores ont été identifiées comme appartenant à Glomus, un grand genre fongique associé aux racines des plantes33, tandis que plusieurs spores de levure ont été identifiées dans deux échantillons néolithiques appartenant à des sites différents, suggérant probablement la consommation d'aliments fermentés.

Pour plus de détails concernant l'analyse des micro-débris, veuillez vous reporter à la discussion supplémentaire.

Enfin, nous avons effectué une reconstruction de novo en assemblant plusieurs MAG, parmi lesquels le plus abondant a été identifié comme Olsenella sp. taxon oral 807 (Données supplémentaires 9, Fig. 13 supplémentaire). Nous avons donc décidé d'étudier plus avant cette espèce, à la fois pour être présente parmi de multiples échantillons appartenant à différentes phases néolithiques, et aussi pour être déjà décrite comme un possible biomarqueur microbien associé à cette transition16. Comme prévu, l'analyse phylogénétique a indiqué que les anciens génomes d'Olsenella étaient étroitement liés à la référence moderne de cette espèce, mais ils ont été divisés en deux groupes différents : l'un composé de quatre génomes reconstruits à partir des échantillons les plus anciens et l'autre de deux échantillons CA qui étaient phylogénétiquement plus proches de la référence moderne (Fig. 5a). Certaines régions étaient généralement manquées parmi tous les génomes anciens (Fig. 5b) et pourraient être liées à des éléments d'évolution plus récents. Dans l'ensemble, un total de 123 régions ont été appauvries dans les génomes anciens, correspondant à plusieurs familles de protéines (Fig. 14 supplémentaire et données supplémentaires 10). La plupart des parties de ces régions ne contenaient que des protéines hypothétiques. Deux grandes lacunes, situées à ~ 1900 kbp et ~ 2200 kbp, contenaient des familles de protéines impliquées dans les mécanismes de défense et les interactions avec d'autres commensaux microbiens : protéine associée à CRISPR, antitoxine HigA, élément mobile, protéines du domaine Fic et intégrase/recombinase et famille de résistance à la tétracycline (TetR).

Le panneau a rapporte l'analyse phylogénétique des six génomes anciens reconstruits (boîte bleu clair), ainsi que 17 Olsenella sp. références, tel qu'effectué par PATRIC100. Dans le panneau b, il est possible d'observer l'analyse d'alignement menée avec BRIG99. Le cercle violet indique l'Olsenella sp. référence au taxon oral 807, tandis que les génomes anciens sont identifiés par le code des échantillons à partir desquels ils ont été assemblés.

Pour plus de détails concernant la reconstruction du génome, veuillez vous reporter à la discussion supplémentaire.

Ces dernières années, une image plus détaillée de l'Europe ancienne a émergé, grâce aux efforts conjoints dans les domaines de l'archéologie et de la génétique humaine34,35. Cependant, il nous manque encore quelques tesselles de la mosaïque globale. Par exemple, les connaissances concernant l'évolution du microbiome humain sont encore insaisissables et fragmentaires.

Dans la présente étude, nous avons suivi l'évolution des symbiotes humains tout au long de la période néolithique, en comparant le microbiome néolithique à celui des chasseurs-cueilleurs du Paléolithique supérieur et des populations ultérieures de l'âge du cuivre. Nous avons observé différents clusters jusqu'alors non détectés dans la littérature scientifique, caractérisés par des profils microbiens oraux spécifiques qui suivent l'évolution chronologique de ces populations.

La plupart des changements détectés dans l'abondance des espèces au fil du temps pourraient être liés à des changements dans les stratégies de subsistance (comme celle entre chasseurs-cueilleurs et agriculture) ou à des modifications des éléments qui constituent le régime néolithique. Une première distinction concerne les échantillons d'AP, dont les microbiomes semblent nettement différents des néolithiques ultérieurs, d'un point de vue taxonomique et fonctionnel. Les microbiomes des individus de chasseurs-cueilleurs analysés sont très similaires, bien qu'ils appartiennent à une longue période chronologique qui englobe le dernier maximum glaciaire et éventuellement un remplacement de population dans la période suivante36,37. Cela peut être considéré comme le reflet d'une stratégie de subsistance similaire de longue date basée sur un degré substantiel de consommation de protéines et de graisses animales, ainsi que de féculents, comme suggéré en combinant les microrestes et les résultats fonctionnels rapportés ici, avec les données archéozoologiques de la grotte de Paglicci38,39. Les différences identifiées dans les voies des glucides entre les échantillons PA et néolithiques sont probablement liées à une variation des sources de glucides sélectionnées. En effet, l'analyse des microrestes a révélé un degré plus élevé de variabilité taxonomique dans les grains d'amidon consommés parmi les échantillons de PA par rapport aux échantillons néolithiques (voir Discussion supplémentaire), ce qui est conforme à la plus grande abondance de la voie du métabolisme de l'amidon bactérien. Fait intéressant, des preuves d'enregistrements d'amidon attribuables à l'avoine (Avena cf. barbata) ont été détectées à la fois dans le tartre dentaire de cinq individus PA (trois Gravettiens et deux Épigravettien), et sur une meule mise au jour dans une couche du Gravettien précoce du même site de la grotte de Paglicci, fournissant de multiples sources de preuves de la consommation de cette plante à travers toutes les phases paléolithiques considérées38.

À l'inverse, les échantillons néolithiques étaient caractérisés par un groupe restreint de grains d'amidon pendant toutes les phases néolithiques examinées, et par différentes variables taxonomiques et fonctionnelles liées au métabolisme des glucides, des vitamines et des acides aminés ainsi qu'aux facteurs de virulence.

D'un point de vue taxonomique, avec le début de la transition néolithique, des espèces qui étaient auparavant mal attestées au cours de l'AP en tant que membres pathogènes des complexes rouge et orange, ainsi que d'autres taxons (c. Les espèces bactériennes appartenant aux complexes rouge et orange se co-agrègent et sont des agents étiologiques connus des maladies parodontales27. Ils portent plusieurs facteurs de virulence (par exemple des fimbriae et des protéases) avec des capacités protéolytiques capables d'affecter le tissu conjonctif de l'hôte et de déclencher un dysfonctionnement de la réponse immunitaire40. Récemment, la présence de P. gingivalis a également été associée à plusieurs conditions inflammatoires extra-orales telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète et la maladie d'Alzheimer, et il semble exercer une influence directe sur la composition microbienne de l'intestin de l'hôte41,42,43. Ainsi, l'augmentation observée des facteurs de virulence à travers toutes les phases néolithiques, et en particulier pendant les périodes LN/CA, repose principalement sur l'abondance accrue des espèces du complexe rouge. Dans l'ensemble, les échantillons du Néolithique étaient également caractérisés par la présence d'un métabolisme du galactose, qui pourrait probablement être lié à la consommation de produits laitiers. Le galactose est métabolisé à partir du lactose, un sucre disaccharidique dont le lait et ses produits dérivés sont les principales sources alimentaires44, capables de stimuler la croissance des bactéries fermentant le lactose45. En fait, l'identification des spores de levure à partir de l'analyse des micro-débris peut suggérer la consommation d'aliments fermentés, qui pourraient être liés à une source de lait. Le début de l'exploitation des sous-produits animaux est généralement signalé pour les périodes postérieures au Néolithique46, mais la consommation de lait a commencé beaucoup plus tôt, comme le confirment également les restes lipidiques sur les pots, ainsi que les archives archéozoologiques des sites italiens contemporains47. Plusieurs caractéristiques taxonomiques et fonctionnelles n'étaient pas également réparties sur l'ensemble de la période néolithique, mais plutôt une différence significative a été trouvée entre les phases antérieure et postérieure. Les sujets appartenant à la première partie de la période néolithique (c'est-à-dire EN et MN), correspondant aux cultures Impressed Ware et Passo di Corvo, partagent des éléments taxonomiques et fonctionnels communs et présentent des traits intermédiaires entre les deux extrêmes constitués par PA et LN-CA. Ces éléments définissent les premières phases comme une sorte d'« état de transition », ce qui pourrait expliquer l'absence de marqueurs forts dans les analyses précédentes qui se sont principalement concentrées sur le début de la transition agricole16,48. De plus, le scénario proposé est conforme à l'analyse des isotopes stables, qui a montré que les premières communautés agricoles du centre-sud de l'Italie consommaient une large gamme d'aliments, démontrant la continuité avec les précédentes communautés de chasseurs-cueilleurs26. Par conséquent, notre résultat appuierait l'hypothèse selon laquelle la transition vers la nouvelle stratégie de subsistance a été progressive et spécifique à la région, avec une forte adaptation des nouveaux arrivants néolithiques aux ressources disponibles localement, au lieu d'un changement radical vers un régime alimentaire homogène, comme cela a également été rapporté par les données isotopiques et botaniques, ainsi que des preuves de la continuité des pratiques culinaires dans d'autres régions européennes49,50,51. Le site de Palagiano était le seul à présenter une forte variabilité intra-site, qui n'était associée à aucune métadonnée anthropologique (par exemple l'âge, le sexe ou les pathologies). Cependant, il convient de noter que des preuves archéologiques ont mis en évidence l'existence de différents modèles funéraires dans un même site, qui ont été interprétés comme le reflet d'une différenciation sociale52. Considérant que la plupart des parties des échantillons appartenant à la même sépulture ont été regroupées dans le même cluster (C3) selon l'analyse taxonomique, on peut supposer que les différenciations sociales hypothétiques pourraient indiquer une différence d'accès aux ressources ou de choix alimentaires.

A l'inverse, au cours de la seconde moitié du Néolithique, de multiples traits taxonomiques et fonctionnels laissent supposer l'adoption d'un régime alimentaire hyperglucidique/hypoprotéique. La présence plus élevée de Capnocytophaga spp., ainsi que d'Ottowia HOT 894, Neisseria elongata et Rothia aerea, qui étaient tous enrichis en échantillons de LN et CA, a été associée à une consommation plus élevée de fibres alimentaires, à la fois dans le microbiome salivaire végétalien et dans le microbiome de la plaque, respectivement17,19. De plus, le microbiome oral de la population végétalienne moderne démontre également une augmentation des voies spécifiques d'acides aminés, telles que la biosynthèse de la lysine, de la glycine et de la cystéine, qui se sont considérablement enrichies même parmi les échantillons de LN et de CA19. La présence de ces traits suggère une augmentation de l'apport en glucides au cours des périodes LN/CA, et correspond aux données enregistrées par les analyses isotopiques, signalant une tendance à la baisse de l'apport en protéines animales et une augmentation de la consommation de protéines végétales de EN à LN et CA, ainsi qu'une intensification des pratiques agricoles dans les communautés agricoles du sud de l'Italie à la fin de la période néolithique25,53. De plus, et toujours pendant la période LN, les registres botaniques ont reconnu un changement dans la sélection des ressources glucidiques, avec une réduction de la variabilité taxonomique des céréales et des légumineuses et une augmentation des plantes résistantes à la sécheresse (ex. orge et petit épeautre - Hordeum spp. et Triticum monococcum-)24. Cette modification des pratiques agricoles a été associée à des conditions environnementales spécifiques, plus qu'à des choix culturels, liés à l'apparition de deux phases climatiques sèches qui ont affecté l'Italie du Sud entre les périodes FMN et LN (4500-4000 avant J.-C.) et lors du passage de LN à CA (4000-3500 avant J.-C.)24 (Fig. 15 supplémentaire).

En combinant les enregistrements botaniques avec les données isotopiques citées et nos résultats, nous émettons donc l'hypothèse que les raisons de l'altération de la composition microbienne au cours du Néolithique tardif pourraient être liées à des changements dans les composants alimentaires (par exemple, les céréales et les plantes comestibles). Les populations locales ont probablement appliqué ces changements pour faire face à des conditions climatiques plus sèches, qui ont pu influencer la disponibilité des plantes alimentaires précédemment consommées24. Les variations alimentaires, qui ont affecté l'apport en glucides, ont finalement fait varier l'abondance des espèces orales et la composition microbienne de la plaque17.

La communauté microbienne orale des échantillons LN/CA présente la plus grande abondance d'espèces liées aux complexes rouge et orange et de facteurs de virulence, suggérant que les écosystèmes oraux des populations LN et CA souffraient d'un état de santé pire que ceux de leurs ancêtres récents. Dans ce cadre, il convient de noter que les analyses anthropologiques, principalement extraites d'articles publiés (voir Supplémentaire. Discussion), ont rapporté que la plupart des échantillons considérés pour les périodes LN et CA étaient caractérisés par une incidence plus élevée de maladies bucco-dentaires. À l'inverse, les échantillons PA ont démontré de bonnes conditions de santé bucco-dentaire, tandis que les échantillons EN/MN représentaient une faible incidence de parodontite et de caries (Données supplémentaires 1). Cette tendance est également en accord avec des études antérieures sur les restes osseux, qui suggéraient déjà un déclin de l'état de santé bucco-dentaire associé à la transition vers l'agriculture54,55.

Considérant des aspects supplémentaires de l'état de santé des populations néolithiques, nous avons détecté la présence de diatomées, suggérant la consommation d'eau polluée, ce qui aurait pu avoir des implications importantes pour la santé humaine56.

Enfin, des facteurs supplémentaires expliquant les changements observés dans l'écologie bactérienne peuvent être liés à la variation génétique au cours de l'évolution du génome des symbiotes, ce qui pourrait avoir affecté l'interaction et l'adaptation des espèces. Les bactéries vivant au sein d'une même communauté partagent principalement des interactions négatives (c'est-à-dire la compétition) plutôt que positives (c'est-à-dire la coopération), surtout si elles vivent dans un environnement riche en biodiversité où la compétition pour les nutriments devient plus forte57. Les toxines antibactériennes, ainsi que d'autres facteurs de virulence, sont les armes utilisées par les espèces pour entrer en compétition, créant de fortes interactions négatives entre elles58. L'analyse de l'ancienne Olsenella sp. Les génomes du taxon oral 807 ont détecté un certain nombre d'éléments manquants, principalement liés aux facteurs de virulence et à la formation de biofilms, par rapport aux génomes modernes, ce qui suggère que sa capacité à rivaliser et à interagir avec d'autres espèces orales vivant dans la même niche a évolué récemment. Ceci, combiné à la pression sélective plus forte exercée par les changements alimentaires, aurait finalement affecté l'écologie du microbiome oral.

En conclusion, notre analyse met en évidence la présence de deux changements principaux affectant l'abondance de plusieurs espèces de microbiome oral dans les populations étudiées : (i) le premier est lié à la transition culturelle associée à l'introduction du mode de vie agricole dans cette région, qui a entraîné une modification initiale de la composition du microbiome tout en conservant certains aspects des échantillons de chasseurs-cueilleurs précédents ; (ii) le second, survenu au Néolithique final, et est probablement lié à l'adaptation à des éléments alimentaires distincts, lorsque les changements observés dans la première phase se sont accentués et que certaines espèces fortement présentes chez les chasseurs-cueilleurs ont quasiment disparu, probablement en raison de l'adaptation progressive des agriculteurs à des éléments alimentaires distincts.

En accord avec la Surintendance locale du patrimoine culturel, 79 échantillons ont été prélevés sur plusieurs sites archéologiques dans la même zone géographique (centre-sud de l'Italie) où la période néolithique a commencé ~ 6200 avant JC, dans la péninsule. Afin d'obtenir une compréhension approfondie de l'ensemble de la période néolithique, nous avons collecté des échantillons qui couvraient toute la transition, de son début à sa fin, en suivant les principales subdivisions archéologiques et culturelles de cette période : néolithique ancien (EN, correspondant approximativement à la culture de la céramique imprimée, du VIIe au VI millénaire avant J. céramique peinte de la fin du VI au milieu du V millénaire avant J.-C.), Néolithique tardif (LN, correspondant à la céramique de Diane, de la seconde moitié du V au début du IV millénaire avant J.-C.). De plus, nous avons considéré à la fois les individus chasseurs-cueilleurs antérieurs de la même zone sur le site de la grotte de Paglicci (PA, correspondant aux contextes culturels du Gravettien et de l'Épigravettien du Paléolithique supérieur) et la phase post-néolithique, appelée l'âge du cuivre (CA, correspondant aux céramiques de Gaudo et Laterza). Afin de contraster tout biais potentiel lié à la biogéographie buccale, les calculs dentaires molaires, lorsqu'ils étaient disponibles, ont été principalement échantillonnés (tableau supplémentaire 1)59. Plus d'informations concernant le site archéologique étudié, le contexte culturel et la datation au radiocarbone sont présentées dans le tableau supplémentaire 1 et les méthodes supplémentaires.

L'extraction et le séquençage de l'ADN ont été effectués sur 76 échantillons dans un laboratoire dédié au nettoyage de l'ADNa au Département de biologie de l'Université de Florence (Italie), en suivant des directives validées pour éviter la contamination de l'ADN moderne60. Après décontamination sous lumière UV pendant 10 minutes, le tartre a été grossièrement broyé avec un micropilon stérile et traité conformément à la procédure A de Modi et al.61 qui permet l'analyse conjointe du matériel génétique et des résidus alimentaires du même échantillon de tartre. En bref, après une nuit de digestion dans 1 mL de tampon d'extraction (0,45 M EDTA pH 8,0, 0,25 mg/mL de protéinase K, 0,05 % de Tween 20), les culots résiduels ont été stockés pour l'analyse des microrestes, tandis que l'ADN a été extrait à l'aide d'un protocole spécifique de colonne de rotation de silice conçu pour récupérer les molécules courtes62. Après avoir centrifugé à vitesse maximale pendant 2 min, le surnageant a été incubé avec 10 mL de tampon de liaison (chlorhydrate de guanidine 5 M, 0,05 % de Tween 20, 40 % de 2-propanol) et 400 µL d'acétate de sodium 3 M pH 5,2 dans des colonnes de silice (High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, Roche Diagnostic – Mannheim, Allemagne). Après deux étapes de lavage avec le tampon de lavage (kit grand volume d'acide nucléique viral hautement pur, Roche Diagnostic - Mannheim, Allemagne), l'ADN a été élué deux fois dans 50 µL de tampon TET (1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,05 % Tween 20). Vingt microlitres de chaque extrait ont ensuite été convertis dans des bibliothèques Illumina à double index63,64 sans traitement à l'uracile ADN glycosylase (UDG) afin de conserver les erreurs d'incorporation de nucléotides. Une combinaison unique de deux index longs de 8 bases a été ajoutée aux deux extrémités de chaque molécule de la bibliothèque par 10 cycles de PCR. Le volume entier de la bibliothèque a été divisé en 4 réactions et a été utilisé comme matrices dans 100 µl de réactions PCR contenant 1x tampon de réaction Pfu, 2,5 U Pfu Turbo ADN polymérase (Agilent Technologies - Santa Clara CA, États-Unis), 250 µM chaque dNTP et 200 nM chaque amorce d'indexation (amorce P5 : AATGATACGGCGACCGAGATCTACACxxxxxxxxACACTCTTTCCTACACGACGCTCTT ; amorce P7 : CA AGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGGTTCAGACGTGT). Les conditions de cyclage comprenaient une étape d'activation de 2 min à 95 °C, suivie de 10 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, un recuit à 58 °C pendant 30 s et un allongement à 72 °C pendant 1 min, avec une étape finale d'extension à 72 °C pendant 10 min. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification MinElute PCR (QIAGEN - Hilden, Allemagne) et élués dans 25 µl de tampon TET. Après un contrôle qualitatif et quantitatif avec Agilent TapeStation (D1000 ScreenTape et réactifs, Agilent Technologies – Santa Clara, CA, USA), les librairies ont été regroupées en quantités équimolaires et séquencées sur une plateforme Illumina NovaSeq 6000 en mode paired-end avec 2 × 51 + 8 + 8 cycles65.

L'analyse microscopique a été réalisée sur 27 échantillons par le Laboratoire de palinologie de l'Université de Florence pour les échantillons paléolithiques, et par le laboratoire DANTE-Diet and ANcient TEchnology de l'Université Sapienza de Rome, pour les échantillons néolithiques et de l'âge du cuivre. Sur la base de notre expérience, il est possible de récupérer et d'analyser les microrestes, à partir du culot d'échantillon utilisé pour extraire l'ADNa dans un laboratoire propre approprié61. De plus, six échantillons ont été analysés pour les deux sources (c'est-à-dire le tartre dentaire et la pastille), afin de comparer davantage les résultats obtenus.

L'échantillonnage du tartre dentaire a été effectué selon le protocole systématisé par Sabin et Fellow Yates66, avec quelques variations (par exemple, les lames jetables ont été changées après chaque extraction d'échantillon). Les procédures d'extraction et de décontamination ont suivi des protocoles standard publiés66,67,68 et ont été menées dans des espaces propres dédiés non connectés aux travaux botaniques modernes et sous une surveillance environnementale stricte. Le nettoyage a été effectué quotidiennement afin d'éviter tout type de contamination moderne. Les surfaces de l'espace de paillasse ont été nettoyées avant l'analyse de chaque échantillon, en utilisant du savon et de l'éthanol, recouvertes de papier d'aluminium et en utilisant des gants en nitrile propres et sans amidon à tout moment. Le nettoyage du tartre a été effectué sous un stéréomicroscope, sur une boîte de Pétri préalablement lavée, avec des grossissements allant jusqu'à 100×. L'élimination du sol minéralisé adhérant à la surface du calcul a été méticuleusement effectuée, en utilisant des pincettes stériles pour maintenir l'échantillon et une fine aiguille d'acupuncture pour gratter doucement le sol attaché à la couche externe de la plaque minéralisée. La procédure a été réalisée en utilisant des gouttes d'acide HCl 0,5 M pour dissoudre les particules de sol minéralisées et de l'eau ultra pure pour bloquer la déminéralisation, ainsi que pour laver et éliminer les contaminants. Le sol minéralisé retiré a été stocké dans des tubes en plastique pour une analyse de contrôle. Ensuite, le calcul propre a été lavé dans de l'eau ultrapure jusqu'à trois fois, pour éliminer toute trace de sédiment meuble, dissous dans une solution de HCl 0,5 M, puis monté sur des lames en utilisant une solution de glycérol 50:50 et d'eau ultrapure. De plus, des échantillons de contrôle des tables de travail propres et des pièges à poussière ont été collectés et analysés à des fins de comparaison, afin d'éviter tout type de contamination moderne. Il s'agit d'une pratique couramment pratiquée dans nos laboratoires, même en l'absence d'analyses archéologiques, pour permettre une meilleure compréhension du flux des contaminations au fil des saisons. Nous n'avons récupéré aucun débris morphologiquement similaire à l'un des restes dans les échantillons de contrôle environnemental. Les grains d'amidon représentaient une fraction très mineure de la « poussière » du laboratoire. Les pastilles ont été traitées avec du HCl à 10 % pendant 12 h et incluses dans une solution eau-glycérine à 50 % v/v. L'analyse a été réalisée sous microscopie optique, sous lumière à fond clair et lumière polarisée croisée. Les micro-débris incrustés dans la matrice de tartre et dans la pastille ont été analysés à l'aide d'un Zeiss Imager2, avec des grossissements allant de 100× à 630×.

Pour l'identification des grains d'amidon archéologiques, une collection de référence moderne de 300 plantes originaires de la région méditerranéenne et d'Europe a été utilisée, ainsi que la littérature publiée, et avec l'Herbier Centrale Italicum (FI) et des échantillons collectés au Jardin Botanique de l'Université de Florence30,38. Les spores ont été identifiées par comparaison avec la littérature disponible69. Les groupes de grains ont été comptés comme une présence. La nomenclature des phytolithes était conforme à l'ICBN 2.0.

Les séquences métagénomiques ont été traitées pour leur qualité, et les séquences adaptatrices ont été coupées et les lectures appariées ont été réduites à l'aide du logiciel AdapterRemoval (v2.2.0)70 avec les options suivantes : -minlength 30 –minquality 25 –trimns –trimqualities –collapse. Ensuite, les doublons de séquences ont été supprimés à l'aide de Prinseq71 (v 0.19.1) (https://prinseq.sourceforge.net/) et analysés avec Kraken2 (v.2.0.8-beta) pour l'identification taxonomique72. Nous avons créé une base de données personnalisée, mise à jour jusqu'en décembre 2020, des génomes bactériens, viraux, archéens et mitochondriaux à partir de la base de données NCBI Reference Sequence (RefSeq) (https://www.ncbi.nlm.gov/refseq/). Pour éviter une fausse classification, nous avons masqué les génomes de référence pour les régions à faible complexité avec Dustmasker (v.1.0.0) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569845/). La sortie de Kraken2 a ensuite été analysée via le logiciel Bracken (v.2.5) pour estimer les abondances de lecture des espèces73 (Données supplémentaires 11). Cette même approche a été utilisée pour les échantillons métagénomiques de microbiomes modernes et anciens de référence utilisés pour l'analyse comparative exploratoire et rapportés dans le tableau supplémentaire 3. Nous avons sélectionné les espèces qui étaient présentes à une abondance relative supérieure à 0,02 dans l'ensemble de données. Ce type de filtre taxonomique a été préconisé pour réduire l'influence possible des espèces à faible abondance et des singletons présents dans l'ensemble de données, et il est plus approprié que l'approche classique de raréfaction74,75. Grâce au seuil appliqué, nous avons obtenu 49 espèces qui ont ensuite été validées pour leur profil de déamination et confirment ainsi leur ancienneté. Nous avons aligné chaque lecture d'échantillon sur ses génomes de référence respectifs déposés dans la base de données NCBI RefSeq, en utilisant uniquement les espèces signalées comme « référence » ou « représentant ». Le programme Burrows-Wheeler Alignment (BWA v.0.7.15)76 a été utilisé dans ce but, en utilisant l'algorithme aln avec une forte stringence (-n 0,1). Les séquences alignées ont ensuite été étudiées pour leur profil de désamination de la cytosine à l'aide de PMDtools (v.0.60) (–threshold 1 –requiremapq=30) (https://github.com/pontussk/PMDtools). Pour chacune des espèces alignées, nous avons converti les fichiers bam en lit à l'aide de bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) et estimé la distance d'édition (-tag NM) qui a ensuite été utilisée pour calculer l'algorithme de distance d'édition (–Δ%), afin de confirmer davantage l'authenticité de la séquence77. Comme indiqué précédemment, nous avons évalué –Δ% > 0,8 comme étant authentique, pour évaluer d'éventuels événements de transfert horizontal ou la présence d'espèces génétiquement étroitement liées dans le microbiome des échantillons78. Toutes les informations concernant le profil de désamination et -Δ% pour chaque espèce et tous les échantillons sont rapportées dans le tableau supplémentaire 4. Nous avons en outre évalué le niveau de fragmentation des lectures et les différences dans le profil de désamination sur toutes les différentes périodes étudiées ici, pour observer l'effet des événements taphonomiques au fil du temps (Figs. 4 et 5 supplémentaires).

Pour étudier l'étendue de la contamination moderne possible et pour authentifier les sources orales de nos échantillons anciens, nous avons comparé les profils de microbiome obtenus avec ceux des échantillons métagénomiques modernes et anciens. Des microbiomes modernes fécaux, du sol, de la peau et de la bouche (tartre dentaire et plaque dentaire) ont été extraits des archives européennes de nucléotides, tandis que de nouveaux contrôles environnementaux et de laboratoire ont été générés (tableau supplémentaire 3). Deux échantillons de sol prélevés directement dans les régions des Pouilles et des Marches, et avec deux contrôles de laboratoire (c'est-à-dire issus des processus d'extraction et de séquençage). De plus, d'anciens microbiomes oraux précédemment rapportés provenant d'autres études ont été ajoutés comme contrôles supplémentaires. Nous avons étudié les positions de nos échantillons par rapport aux références modernes et anciennes grâce à une mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique des distances de Bray-Curtis, basée sur la distribution des espèces à l'aide du package phyloseq (v.1.30.0) du logiciel R (v. 3.6.3) (Discussion supplémentaire). De plus, nous avons estimé le pourcentage de la source orale dans notre ensemble de données, à l'aide de Sourcetracker (https://github.com/danknights/sourcetracker), en considérant un sous-ensemble de microbiomes modernes obtenus à partir de métagénomique de fusil de chasse à l'aide de la plate-forme Illumina, et ayant> 10 millions de lectures comme sources (SI, Fig. 2 supplémentaire). Les échantillons démontrant une source orale élevée (> 75 %) ont été retenus pour l'analyse. Enfin, afin d'éliminer d'éventuels contaminants, nous comparons les espèces identifiées avec la Human Oral Microbiome Database (HOMD) pour assurer la sélection des espèces orales humaines connues. En ce sens, la seule espèce mise en cause était Burkholderia pseudomallei qui est une bactérie environnementale et l'agent causal de la mélioïdose chez l'homme79. Le genre Burkholderia a été détecté dans la cavité buccale humaine et dans la plaque dentaire80,81, mais aucune preuve de B. pseudomallei n'a été décrite précédemment pour le tartre dentaire, nous ne pouvons donc pas exclure que sa présence puisse être liée à un contaminant ancien ou non.

La sortie de Bracken a été utilisée pour étudier la distribution des espèces parmi les échantillons à l'aide du logiciel R (v. 3.6.3). Tout d'abord, les données ont été normalisées par une transformation de rapport logarithmique centré (clr), introduite par Aitchison, à l'aide du package microViz (v.0.9.0). Cette transformation rend les données symétriques, invariantes à l'échelle et linéairement liées, plaçant les données dans un espace de coordonnées de rapport logarithmique82. Cette approche est l'une des plus adaptées pour normaliser les données de composition83. Pour explorer l'existence de groupes possibles au sein de notre cohorte grâce à une approche non supervisée, nous avons effectué la statistique d'écart au niveau du genre, qui est une méthode standard qui détermine le nombre de grappes dans un ensemble de données84. Nous avons appliqué la fonction clusGap du package cluster (v.2.1.0)85 pour calculer la qualité de la mesure de clustering sur un objet phyloseq (v.1.30.0)86 avec un bootstrap de 100. Ensuite, nous avons utilisé NetCoMi (v.1.0.2)87 pour générer un réseau afin d'étudier la relation partagée par les échantillons en fonction de la distance d'Aitchison au niveau du genre, qui est plus stable pour le sous-ensemble et l'agrégation des données, et pour étant une vraie distance linéaire83. Les données ont été dispersées avec l'algorithme k-plus proche voisin (k-nn) et une analyse de clustering hiérarchique a été appliquée, en utilisant la méthode de liaison moyenne et la valeur k obtenue par la statistique d'écart (méthode = "moyenne", k = 5). Nous avons utilisé l'analyse de réseau pour mettre en évidence les connexions entre les échantillons (pas seulement leur distance) et identifié les grappes existantes en fonction de la composition du microbiome des échantillons. Pour corroborer davantage cette approche avec une analyse plus classique, nous avons effectué PCoA en utilisant la distance d'Aitchison, et effectué PERMANOVA et ANOSIM pour valider la subdivision des clusters identifiée par réseau ; nous avons également vérifié l'influence possible du nombre de lectures, de l'extraction et du lot de bibliothèques. Nous avons appliqué Adonis par paires (https://github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis) pour mettre en évidence les différences entre les paires de clusters.

Afin de comprendre lesquelles des quelques métadonnées disponibles (c'est-à-dire la période, le site, l'âge du décès ou le sexe) peuvent avoir joué un rôle majeur dans la distinction des grappes, nous avons appliqué une classification aléatoire des forêts avec 100 arbres, en utilisant le package radiant (v.1.4.0) (https://github.com/radiant-rstats/docs). La forêt aléatoire a identifié l'influence relative de chaque caractéristique sur le modèle créé pour classer le résultat du cluster. Pour valider le modèle de classification obtenu à partir d'une analyse de forêt aléatoire, nous avons effectué un test d'association à l'aide de la fonction assoc du package vcd (v. 1.4-9) qui calcule la valeur du chi carré de Pearson (X2), conçue pour évaluer l'écart par rapport à un modèle d'indépendance dans des données catégorielles.

Pour explorer et identifier les espèces dont l'abondance a significativement changé au fil du temps, nous avons appliqué une double approche. Nous avons comparé la composition des grappes à l'aide de DESeq2 (v.1.26.0), en n'acceptant comme significatives que les espèces qui montraient un p ajusté <0,05 et qui montraient une signification à partir de plus d'une comparaison, afin d'éviter d'éventuels résultats significatifs erronés. Ensuite, pour mettre en évidence les associations les plus fortes des espèces avec les clusters et les variables de période, nous avons effectué une analyse multivariée par modèle linéaire (MaAsLin v.1.0). Ce cadre statistique applique un modèle linéaire général pour détecter les associations entre les métadonnées cliniques et les taxons microbiens, et il est largement utilisé dans les études épidémiologiques modernes88. Les paramètres qui ont été appliqués pour cette analyse étaient les suivants : un taux maximal de fausses découvertes (seuil de signification) égal à 0,05 ; un minimum pour le filtrage de l'abondance relative des caractéristiques égal à 0,001 ; un minimum pour le filtrage de la prévalence des caractéristiques égal à 0,01. Les espèces différentiellement abondantes ont été regroupées en fonction de leur appartenance aux complexes écologiques qui constituaient la communauté microbienne orale27.

En plus du profil taxonomique, nous avons évalué si les changements dans la composition du microbiome pouvaient correspondre à des différences de profil fonctionnel grâce à une analyse du contenu génétique réalisée avec HUAnN 2.089. Nous avons évalué le profil de contenu génétique dans nos échantillons et les avons regroupés à l'aide de UniRef90_ko. Afin d'éviter les biais dans le contenu des gènes liés aux contaminants modernes, les profils obtenus ont été filtrés, en sélectionnant les espèces qui ont été précédemment validées comme étant authentiquement anciennes. Nous avons comparé les distributions d'orthologues KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) obtenues à l'aide de LEfSe (v.1.0)90 et avons sélectionné uniquement les résultats avec p <0,05 et LDA supérieur à 2. En ce qui concerne l'identification du facteur de virulence (VF), les gènes détectés comme étant significatifs ont été comparés à une base de données personnalisée contenant des informations de la Virulence Factor Database (VFDB) générée par Chen et al.91.

Dans l'ensemble, les tracés ont été produits à l'aide de ggplot2 (v.3.3.5)92, avec une palette adaptée aux daltoniens93.

La reconstruction d'un ancien génome oral s'est poursuivie à la suite de l'étude de Wibowo et al. pipeline9 pour la validation des contigs. Chaque échantillon a été assemblé à l'aide de SPAdes94 (v.3.15.3) avec l'option --meta. Chaque échantillon a été mappé par rapport aux contigs assemblés relatifs à l'aide de Bowtie2 (v.2.3.5.1)95 avec les paramètres par défaut. Les sorties ont été indexées et triées via SAMtools (v.1.9)96 et les fichiers BAM générés ont été regroupés séquentiellement à l'aide de MetaBAT 2 (v.2.12.1)97. Une évaluation de la qualité de l'assemblage a été effectuée via un flux de travail spécifique à la lignée dans CheckM (v.1.1.6)98, testant l'exhaustivité du génome, le niveau de contamination, la couverture, les valeurs N50, la longueur moyenne du contig et la taille du plus grand contig (voir le tableau supplémentaire S5). Les contigs assemblés ont ensuite été utilisés pour l'identification taxonomique avec Kraken2. Seuls les génomes avec un niveau de complétude supérieur à 85%, un niveau de contamination <5% et une identification taxonomique >95% ont été considérés pour l'analyse suivante. Enfin, pour évaluer le profil de dommages à l'ADNa, le script damageprofiler.sh de Wibowo et al. a été utilisé mais la dernière partie du script a été modifiée à l'aide de PMDtools. Un tracé du profil de désamination pour chaque échantillon a été rapporté dans la Fig. 13 supplémentaire. L'alignement des contigs sur la référence a été effectué avec BLAST Ring Image Generator (BRIG) (v.0.95)99, en utilisant des seuils d'identité supérieur et inférieur de 70 % et 30 %, respectivement. Ce logiciel a été utilisé pour générer à la fois la Fig. 5 et la Fig. 14 supplémentaire, cette dernière contenant l'annotation génétique de référence récupérée par la base de données NCBI.

Les contigs ont ensuite été téléchargés sur PATRIC (v.3.6.12)100 pour une annotation plus poussée, une analyse phylogénétique et protéomique. En particulier, les six génomes reconstruits ont été annotés pour leurs caractéristiques génomiques dans l'espace de travail PATRIC à l'aide de RASTtk101. L'arbre phylogénétique a été construit via RAxML (v.8.2.11)102, en utilisant 23 références de génomes modernes et 159 gènes. Un outil de comparaison de protéomes a ensuite été utilisé pour étudier la similarité des protéines anciennes avec la référence mère et pour identifier les fonctions et les régions manquantes. Il utilise l'algorithme BLASTP pour comparer les séquences de protéines comme étant uniques, un meilleur résultat unidirectionnel ou un meilleur résultat bidirectionnel par rapport au génome de référence. L'outil Protein Family Sorter a été utilisé pour étudier la distribution des familles de protéines qui traversent la limite du genre (PGF) parmi les échantillons anciens par rapport à la référence moderne.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données de séquence générées pour cette étude ont été déposées dans le NCBI Sequence Read Archive (SRA) sous BioProject PRJNA791766. Les données traitées, les données de microscopie ainsi que les données d'assemblage et d'annotation du génome sont contenues dans le document et ses fichiers de données supplémentaires. Des échantillons archéologiques ont été collectés à la "Surintendance de l'archéologie, des beaux-arts et du paysage de la ville métropolitaine de Bari" à Bari (Italie), à ​​la "Surintendance de l'archéologie, des beaux-arts et du paysage des provinces de Barletta-Andria -Trani et Foggia" à Foggia (Italie), à ​​la "Surintendance de l'archéologie, des beaux-arts et du paysage des Marches" à Ancône (Italie), au "Museo delle Origine " à l'Université "La Sapienza" à Rome (Italie), et au musée "Museo delle Civiltà" à Rome (Italie). Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code est disponible sur https://github.com/AndreaQ7/HuME et sur Zenodo103 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7198970).

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Quagliariello, A. Évolution du microbiome humain dans la communauté néolithique italienne. https://doi.org/10.5281/ZENODO.7198970 (Zenodo, 2022).

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Nous remercions le Dr Matteo Tuzzato pour son soutien avec les serveurs. Nous remercions les archéologues et anthropologues de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per la Città metropolitaine de Bari", de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Barletta- Andria -Trani e Foggia" et de la "Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio delle Marche" qui ont engagé une fructueuse collaboration. Nous sommes reconnaissants à A. Palma di Cesnola pour ses recherches à Grotta Paglicci, et à G. Capecchi pour sa contribution à l'organisation des restes humains. Nous remercions également le personnel du SMA - Museo di Storia Naturale di Firenze (Herbarium Centrale Italicum and Botanical Garden) pour la fourniture de matériel de référence. Ce projet a été financé par le programme STARS 2019 de l'Université de Padoue à AQ (Italie). Les analyses effectuées au Département de Biologie de l'Université de Florence ont été couvertes par une subvention interne de l'Université de Florence (Progetto strategyo di Ateneo anno 2014 n. 129323 du 05/10/2015 attribué à ML). L'analyse des micro-débris dans le tartre dentaire néolithique a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme-cadre Horizon 2020 (Starting Grant Project HIDDEN FOODS grant agreement no. 639286 to EC).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Italo Maria Muntoni, Martina Lari.

Département de biomédecine comparée et des sciences alimentaires, Université de Padoue, Legnaro, 35020, Italie

Andrea Quagliariello, Gabriel Innocenti & Maria Elena Martino

Département de biologie, Laboratoire d'anthropologie moléculaire et de paléogénétique, Université de Florence, Florence, 50122, Italie

Alessandra Modi, Valentina Zaro, David Caramelli et Martina Lari

Département des sciences anciennes, Université "Sapienza" de Rome, Rome, 00185, Italie

Cécilia Conati Barbaro

Département des sciences physiques, de la Terre et de l'environnement, UR Préhistoire et Anthropologie, Université de Sienne, Sienne, 53100, Italie

Annamaria Ronchitelli, Francesco Boschin & Stefano Ricci

Département d'Histoire Cultures Civilisations, Université de Bologne, Bologne, 40126, Italie

Claude Cavazzuti

Surintendance ABAP de la ville métropolitaine de Bari, Bari, 70121, Italie

Elena Dellù & Francesca Radina

Section de bioarchéologie - Musée des civilisations, Rome, 00144, Italie

Alessandra Sperduti & Luca Bondioli

Département Asie, Afrique et Méditerranée, Université "L'Orientale" de Naples, Naples, Italie

Alessandra Sperduti

Département du patrimoine culturel, Université de Padoue, Padoue, 35139, Italie

Luca Bondioli

Département de Biologie, Laboratoire de Palynologie, Université de Florence, Florence, 50121, Italie

Miriam Lognoli et Marta Mariotti Lippi

Département des sciences biologiques, géologiques et environnementales, Université de Bologne, Bologne, 40126, Italie

Maria Giovanna Belcastro & Valentina Mariotti

DANTE - Laboratoire de diététique et de technologie ancienne, Département des sciences maxillo-faciales, Université "Sapienza" de Rome, Rome, 00161, Italie

Emanuela Cristiani

Surintendance de l'archéologie, des beaux-arts et du paysage des provinces de Barletta - Andria - Trani et Foggia, Foggia, 71121, Italie

Italo Maria Muntoni

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AQ, IMM et ML ont conçu l'étude. AQ et AM ont recueilli les échantillons de tartre dentaire. AM et VZ ont effectué l'extraction et le séquençage de l'ADN sous la supervision du MLAQ et GI a effectué l'analyse bioinformatique. MML, EC et M.Lo. effectué l'analyse des microrestes. CC, ED, FR, AS, LB, MGB et VM ont réalisé l'étude des restes humains de différents sites du Néolithique et de l'Age du Cuivre. L'IMM et le CCB sont les responsables scientifiques des sites archéologiques du Néolithique et de l'Âge du Cuivre. AR et FB sont les responsables scientifiques de la recherche à la grotte de Paglicci. SR a réalisé l'identification anatomique et l'étude des restes humains de la grotte de Paglicci. AQ, AM, EC, MML et ML ont rédigé l'article avec la contribution de VZ, CCB, AR, FB, DC, MEM et IMM. Tous les auteurs ont révisé et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Andrea Quagliariello ou Alessandra Modi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Nicolas Rascovan et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Quagliariello, A., Modi, A., Innocenti, G. et al. Les microbiomes oraux anciens soutiennent les changements alimentaires néolithiques progressifs vers l'agriculture. Nat Commun 13, 6927 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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Reçu : 03 mars 2022

Accepté : 25 octobre 2022

Publié: 22 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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